期刊简介
本刊是由中国科学技术协会主管，中国药理学会主办学术性刊物，以从事新药开发，临床药理学、药物治疗学研究的高中级医疗、科研及教学人员为读者对象。旨在报道临床药理学与治疗学方面新进展及新成果。
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首页>中国临床药理学与治疗学杂志
- 杂志名称：中国临床药理学与治疗学杂志
- 主管单位：中国科学技术协会
- 主办单位：中国药理学会
- 国际刊号：1009-2501
- 国内刊号：34-1206/R
- 出版周期：月刊
期刊荣誉：中国科技论文统计源期刊期刊收录：统计源核心期刊(中国科技论文核心期刊), 维普收录(中), 上海图书馆馆藏, 知网收录(中), CSCD 中国科学引文数据库来源期刊(含扩展版), 万方收录(中), 国家图书馆馆藏
大鼠核因子-κB反义RNA腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达
胡榕；吴可贵；许昌声
关键词：核因子-κB, 反义RNA, 腺病毒载体, 表达调控, 蛋白免疫印迹, 大鼠
摘要：目的:构建表达大鼠核因子κB(NF-κB, p65)反义RNA的重组腺病毒,并测定受染血管平滑肌细胞(VSMCs)中NF-κB基因的表达变化.方法:从自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)的VSMCs中提取总RNA,经RT-PCR方法获得含全部编码序列的NF-κB (p65)cDNA片段(1 653 bp),用TA克隆技术插入pMD18-T载体,构建pMD18-T/1653重组质粒,并经酶切和DNA测序鉴定.以该质粒为模板,经PCR获得NF-κB(p65)3'端 269 bp 片段,逆向插入pcDNA3.1(+)真核表达载体并置于CMV启动子下.由此构建的pcDNA3.1(+)/269质粒含有NF-κB(p65)的269 bp反义RNA完整表达框.随后将该表达框克隆到入门载体pENTR4,构建重组质粒pENTR4/CMV/269.使用同源重组方式在体外将该表达框重组到腺病毒载体pAd/PL-DEST,终得到重组腺病毒质粒pAd/CMV/269.线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞后产生的重组腺病毒颗粒用于VSMCs的感染.Western Blot测定感染前后VSMCs中NF-κB(p65)表达的变化情况.结果:构建的pMD18-T/1653重组质粒经过序列测定,证实其包含大鼠NF-κB(p65)基因的1653 bp片断;pcDNA3.1(+)/269、pENTR4/CMV/269、pAd/CMV/269等重组质粒经内切酶消化或PCR等方法鉴定无误;线性化的pAd/CMV/269转染293细胞后,可产生完整、具有感染性的重组腺病毒颗粒,病毒在感染上清中的滴度为 9.23×109 pfu·ml-1(plaque form units per milliliter);Western Blot检测证实,感染重组腺病毒的VSMCs中的NF-κB(p65)蛋白水平明显减少.结论:构建了可表达大鼠NF-κB (p65)反义RNA的重组腺病毒Ad/CMV/269,该病毒在受染的VSMCs内具有下调NF-κB (p65)基因表达的生物学功能,为后续的基因治疗研究奠定基础.
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